Morfología y estructura bacteriana
M. Pírez, M. Mota
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lunes, 4 de marzo de 2013
Bibliografía
• Prescott, Harley, Klein. Microbiología. Mc Graw-Hill Interamericana de España. 4ª ed. 1999.
• Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Microbiología. Mecanismos de las enfermedades infecciosas. Ed Panamericana. 2ª ed. Buenos Aires 1993
• Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana;
1994.
domingo, 3 de marzo de 2013
Introducción e importancia del tema
En las
últimas décadas se han hecho importantes avances en el estudio de la
ultraestructura bacteriana,
lográndose una identificación bioquímica de muchas fracciones subcelulares;
estos avances han permitido ubicar a las bacterias en el reino Procaryotae.
El
conocimiento de las diferentes estructuras y composición ha permitido
comprender como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea como
integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismo.
El
descubrimiento de que muchas estructuras bacterianas bien identificadas son
inmunógenos importantes, permitió el desarrollo de vacunas que han sido
verdaderos avances en la medicina de los últimos años. Ejemplo de ello son las
vacunas contra microorganismos causantes de meningoencefalitis supurada como
Haemophilus influenzae tipo b y Neisseria meningitidis (meningococo) A, B y C.
El
conocimiento de la composición bioquímica de las diferentes estructuras
bacterianas, junto al conocimiento del metabolismo bacteriano, permite hoy la
comprensión del mecanismo de acción
de los diferentes antibióticos.
Recientemente,
los avances de la genética bacteriana hicieron posible el desarrollo de técnicas
de biología molecular con aplicaciones a nivel de la investigación científica y
el diagnóstico.
La
observación al microscopio óptico con distintas coloraciones y de los cultivos
bacterianos, tienen un
rol importante en la identificación de las bacterias y su ubicación taxonómica.
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Definición y ubicación taxonómica
Como
característica principal, los procariotas no poseen compartimientos
intracelulares delimitados por membranas, por lo que carecen de membrana
nuclear, a diferencia de los eucariotas. También es importante destacar
que el ADN procariota es circular y cerrado, mientras que el eucariota se
organiza en cromosomas individuales y se asocia a proteínas de
tipo
histonas. Las bacterias poseen una pared celular compuesta por peptidoglicano
(a excepción de los Mycoplasmas) mientras que las células eucariotas no
tienen este tipo de pared (la pared celular de los vegetales es de
celulosa). La reproducción en los eucariotas puede ser tanto sexuada como
asexuada, mientras que los procariotas se reproducen por división simple
(forma asexuada). El tamaño de la célula eucariota es mayor que el de la
procariota.
Los
procariotas no poseen citoesqueleto, a diferencia de los eucariotas. Otra
diferencia es la presencia de fimbrias o pilis en las bacterias. Los
procariotas pueden poseer flagelos, mientras que los de los eucariotas si
los poseen, éstos tienen una estructura más compleja. Por último mencionar
que mientras las células eucariotas se reproducen por mitosis, las
células procariotas lo hacen por fisión binaria. En dicho proceso la
célula crece, se forma un tabique y finalmente se desprenden dos células
nuevas. En este proceso se produce también la replicación del ADN, de
forma que las células hijas contienen cada una un duplicado idéntico del
genoma de la progenitora.
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Tamaño
El tamaño de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3
μm, pudiendo llegar en algunos tipos a 10 μm. Las bacterias de interés
médico tienen un tamaño entre 0.4 y 2 μm. Solo son visibles entonces, al
microscopio óptico o microscopio electrónico. Para observarlas con el microscopio óptico
se usa el objetivo de inmersión (100X), sumergiendo esta lente en una gota de
aceite (aceite de inmersión) en el preparado a observar. A modo
comparativo, una célula eucariota mide más de 5 μm (un eritrocito tiene un
diámetro de 7μm), mientras que un reovirus mide menos de 0.1μm. Su tamaño
pequeño determina una relación entre la superficie y el volumen elevada,
con alta tasa metabólica.
MORFOLOGÍA Microscópica
La forma
de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared
celular. Básicamente, se diferencian según su forma en cocos (esféricas u
ovaladas), bacilos (cilíndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos
(espiral); dentro de estas últimas se encuentran: Treponema, Borrelia y
Leptospira (ver figura 1). Las espirilos varían en el número de vueltas,desde
pocas (Borrelia) a muchas (Treponema). Las bacterias pueden mantenerse unidas
unas con otras después de la división celular, pero conservando siempre la
independencia celular. Si el plano de división es único, podemos encontrar
diplococos o cocos en cadena (microorganismos del género Streptococcus).
Si los planos de división son muchos, los cocos pueden agruparse en
tétradas o en racimos (Staphylococcus). Los bacilos pueden ser muy cortos
(cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden ser redondeados o rectos;
pueden estar aislados, en cadenas, en filamentos o formando letras chinas
(Corynebacterium). Los bacilos curvos pueden tener forma de coma (Vibrio
cholerae).
La
morfología bacteriana debe ser observada con el microscopio óptico o el
microscopio electrónico, dado el tamaño pequeño de estos microorganismos.
El más usado en el laboratorio es el microscopio óptico de campo claro,
pero existen otros como el microscopio óptico de campo oscuro en los que
los organismos aparecen brillantes en fondo oscuro. Este
microscopio permite la visualización de bacterias difíciles de colorear
como el Treponema pallidum, agente de la sífilis.
Las
bacterias pueden observarse sin tinción (examen en fresco) si se las coloca en
glicerol o soluciones no acuosas que aumenten el índice de refracción o
con tinción usando distintas coloraciones que mejoran su visualización ya
que son células incoloras. Dichas tinciones se basan en la afinidad que
presentan los colorantes por las estructuras bacterianas. Los
colorantes catiónicos por ejemplo, son atraídos por los componentes de
carga negativa como los ácidos nucleicos y los polisacáridos. Ejemplo de
este tipo son: el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
El examen
en fresco no es el más usado para observar la morfología bacteriana porque
las bacterias tienen citoplasma incoloro y su índice de refracción no
difiere mucho del vidrio y del agua. Con esta técnica se puede verificar
la existencia de bacterias y evidenciar su capacidad para moverse. El
examen en fresco también puede ser usado con técnicas especiales como la
tinción con tinta china que nos permite determinar la presencia de cápsula
rodeando la bacteria. También puede usarse en el microscopio de campo
oscuro por ejemplo para observar Treponemas o Leptospiras con su
movimiento característico.
Las
coloraciones que se usan para teñir los preparados de bacterias, se pueden
dividir en: simples, diferenciales y especiales. Las primeras, por ejemplo
el azul de metileno, nos permiten observar la existencia de bacterias, su
morfología, su agrupación, la presencia de esporos y la existencia de
otros tipos celulares. Las diferenciales (por ejemplo la coloración de Gram y
la de Ziehl Nielseen) además de lo anterior, permiten la diferenciación de
las bacterias porque usan diferentes colorantes que se comportan distinto
según el microorganismo en cuestión.
Las
tinciones especiales se usan para objetivar distintas estructuras como la cápsula,
el núcleo, los flagelos, los esporos, etc.
Antes de
la coloración hay que realizar la preparación y la fijación del frotis. La
preparación del frotis consiste en extender homogéneamente la muestra (por
ejemplo un cultivo bacteriano) o una suspensión de la misma sobre una
lámina. Una vez preparado el frotis debe secarse y fijarse (por ejemplo
con calor).
Con la
fijación del frotis se pretende obtener la muerte de los microorganismos, la
adhesión a la lámina y la conservación de su morfología. Después de
preparar y fijar el frotis, se puede realizar cualquier tipo de coloración
(simple o diferencial).
La
coloración de Gram es la más usada en bacteriología; debe su nombre a quién la
describió en 1884. Es una coloración diferencial, dado que las bacterias
pueden clasificarse según su respuesta en grampositivas o gramnegativas.
Las primeras se tiñen de color azul violeta y las segundas adquieren un
color rosado o rojo. La diferente reacción de las bacterias a
la coloración de Gram se relaciona con diferencias fundamentales de la
envoltura celular de estas dos clases de células.
En el
cuadro 1 se muestran los colorantes usados, su tiempo de aplicación y la
diferente coloración que adoptan las bacterias grampositivas y
gramnegativas en cada paso de la coloración de Gram.
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Estructuras externas o de la envoltura celular
Membrana
celular
Es una
estructura vital para la bacteria. Representa una barrera que separa el
interior del exterior celular. Consiste en una bicapa lipídica similar a
otras membranas biológicas, compuesta por fosfolípidos anfipáticos; no
posee esteroles a diferencia de las eucariotas (con la excepción de los
mycoplasmas). La membrana se halla estabilizada por puentes de hidrógeno,
interacciones hidrofóbicas y cationes como el calcio y el magnesio que se
combinan con los fosfolípidos cargados negativamente. Insertas en ella se
encuentran múltiples proteínas transmembrana, que facilitan el transporte
de sustancias hidrofílicas a través de ésta. Como las bacterias no
poseen membranas internas todos los sistemas de fosforilación, oxidación y
transporte de electrones (citocromos) para la producción de energía se
encuentran a nivel de la membrana celular.
Los
mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmática que forma vesículas,
túbulos o lamelas. Aunque se han investigado durante años, su función
exacta aún se desconoce; pueden estar involucrados en la formación de la
pared celular durante la división celular o en la replicación del
cromosoma y su distribución a las células hijas. Algunos autores
consideran que los mesosomas son artefactos generados durante la fijación
química de las bacterias para su observación en el microscopio
electrónico. Es necesario realizar más investigaciones para solucionar
esta polémica.
La
membrana celular cumple la función de barrera osmótica, tiene permeabilidad
selectiva y permite el ingreso de nutrientes y la salida de desechos por
mecanismos de transporte activo y pasivo. En ella se encuentran los
sistemas de fosforilación oxidación y el transporte de electrones para la
producción de energía; además tiene las enzimas necesarias para la
síntesis de lípidos, de la pared celular (por ejemplo, el bactoprenol), de
la cápsula, etc. Finalmente la membrana contiene moléculas receptoras
especiales que ayudan a las bacterias a detectar y responder a sustancias
químicas del medio externo.
Pared
celular
Ubicada
por fuera de la membrana plasmática, es una estructura vital para las bacterias
que la poseen. Los fármacos que bloquean su formación producen la lisis y
muerte de las bacterias susceptibles. Excepto los mycoplasmas todas las
bacterias tienen una pared celular que les da forma y las protege de la
lisis osmótica. La pared celular de muchos microorganismos patógenos tiene
componentes que contribuyen a su patogenicidad. La pared puede proteger a la
célula de las sustancias tóxicas y es el sitio de acción de algunos
antibióticos.
Después
de que Christian Gram en 1884 desarrollase la tinción que lleva su nombre, se
comprobó que las bacterias podían clasificarse en dos grupos principales, según
su respuesta a esta coloración. Las bacterias grampositivas se tiñen de
color azul violeta y las gramnegativas adquieren un color rosa o rojo. La
diferencia estructural verdadera entre ambos grupos se puso de manifiesto
con el desarrollo del microscopio electrónico. La pared de una
célula grampositiva está formada por una única capa homogénea de 20 a 80
nm de grosor de peptidoglicano o mureína, situada por fuera de la membrana
celular. Por el contrario, la pared de la célula gramnegativa es más
compleja; posee una capa de 2 a 7 nm de grosor de peptidoglicano rodeada
por una membrana externa.
En las
microfotografías electrónicas se observa un espacio entre la membrana
plasmática y la externa de las bacterias gramnegativas y, a menudo entre
la membrana plasmática y la pared celular en las grampositivas. Dicho
espacio se denomina espacio periplásmico y está ocupado por un gel, el
periplasma. El espacio periplásmico de las bacterias
gramnegativas contiene muchas proteínas que participan en la captación de
nutrientes, por ejemplo enzimas hidrolíticas (proteasas, lipasas,
fosfatasas, β-lactamasas) que convierten las macromoléculas en productos
más pequeños que pueden ser metabolizados por la bacteria. El espacio
periplásmico contiene también enzimas que participan en la síntesis del
peptidoglicano y en la
modificación
de compuestos tóxicos que podrían lesionar la célula. En especies
patógenas, también encontramos a ese nivel factores de virulencia como
colagenasas, hialuronidasas y proteasas. Es posible que las bacterias
grampositivas no tengan un espacio periplásmico visible y secretan enzimas
denominadas exoenzimas, que corresponderían a las periplásmicas de
las bacterias gramnegativas.
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Estructura de la pared celular de las bacterias grampositivas
La gruesa
pared celular de las bacterias grampositivas está constituida principalmente
por peptidoglicano. Se cree que ésta gruesa capa de peptidoglicano es la
determinante de que estas bacterias retengan el cristal violeta de la
coloración de Gram.
Sin embargo,
estas células contienen también una gran cantidad de ácido teicoico:
polisacáridos que se unen al ácido N-acetilmurámico o a los lípidos de la
membrana plasmática.
En este
último caso se denomina ácido lipoteicoico. Tanto los ácidos teicoicos como los lipoteicoicos,
tienen la función de estabilizar la pared celular. Además los ácidos
teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos microorganismos, porque
actúan como antígenos de superficie que se unen a receptores específicos
en las células del huésped.
La
superficie externa del peptidoglicano de las bacterias grampositivas está
generalmente cubierta de proteínas. Los diferentes grupos de bacterias
grampositivas y las diferentes especies difieren en la composición de sus
proteínas y de ácidos.
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Estructura de la pared celular de las bacterias gramnegativas
Si
observamos la pared de las bacterias gramnegativas al microscopio electrónico
podemos observar
tres zonas: la membrana plasmática, el espacio periplásmico que incluye una
fina capa de peptigolicano y la membrana externa. Esta última, exclusiva
de las bacterias gramnegativas, es una bicapa lipídica que difiere de
otras membranas por su capa externa, que está constituida por una molécula
anfipática: el lipopolisacárido (LPS) o endotoxina. Además del LPS, la
membrana externa contiene fosfolípidos y proteínas que la unen al
peptidoglicano.
El LPS
está constituido por tres partes: el lípido A, el polisacárido central o del
core y la cadena lateral O. (Ver figura 6). La región del lípido A está
inmersa en la membrana externa y el resto de la molécula del LPS sobresale
de la superficie celular. El core o polisacárido central está unido al
lípido A. La cadena O u antígeno O, consiste en unidades repetidas de una
subunidad tetrasacárida y es muy variable en su composición entre las
diferentes familias, especies y aún dentro de la misma especie de
bacterias gramnegativas; en cambio, el polisacárido del core es constante
para un mismo género bacteriano. El polisacárido O por su variabilidad
es usado frecuentemente para la clasificación serológica de las bacterias.
La
mayoría de las bacterias sintetizan moléculas de LPS con un antígeno O de
longitud completa, algunas especies fabrican moléculas cortas de antígeno
O y otras casi no lo sintetizan.
Las
formas con poco o ningún antígeno O se conocen como rugosas, en oposición a las
formas lisas productoras de antígeno O de tamaño completo.
Macroscópicamente se observan como colonias de bordes rugosos (LPS
truncado) o colonias lisas (LPS completo).
Una de
las funciones más importantes de la membrana externa es servir como
barrera protectora. Evita o disminuye la entrada de sales biliares,
antibióticos y otras sustancias tóxicas que podrían destruir o lesionar la
bacteria. La membrana externa es más permeable que la plasmática y permite
el pasaje de pequeñas moléculas como glucosa y otros monosacáridos.
Dicho
pasaje se debe a la presencia de porinas, proteínas integrales o
transmembrana que forman canales estrechos por los cuales pasar moléculas
menores de 600 a 700 dalton.
Moléculas
mayores como la vitamina B12 pueden atravesar la membrana externa por
transportadores específicos. Esta membrana externa previene la pérdida de
constituyentes como las enzimas periplásmicas.
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Fundamento de la coloración de Gram
Es probable que la diferencia entre las bacterias grampositivas y gramnegativas se deba a la naturaleza física de sus paredes celulares. El peptidoglicano no se tiñe por sí mismo, más bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida de cristal violeta. Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal violeta y luego se tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante. En la decoloración con etanol, se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el complejo colorante yoduro; así las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las bacterias gramnegativas es muy fina, con menos enlaces y con poros de mayor tamaño. Además, es posible que le tratamiento con alcohol extraiga suficientes lípidos de la membrana externa como para aumentar su porosidad. Por estos motivos el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal violeta yoduro en las bacterias gramnegativas.
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