lunes, 4 de marzo de 2013

Derechos de Autor



Morfología y estructura bacteriana


M. Pírez, M. Mota

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Bibliografía



• Prescott, Harley, Klein. Microbiología. Mc Graw-Hill Interamericana de España. 4ª ed. 1999.

• Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Microbiología. Mecanismos de las enfermedades infecciosas. Ed Panamericana. 2ª ed. Buenos Aires 1993

• Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana; 
1994.

domingo, 3 de marzo de 2013

Introducción e importancia del tema


En las últimas décadas se han hecho importantes avances en el estudio de la ultraestructura bacteriana, lográndose una identificación bioquímica de muchas fracciones subcelulares; estos avances han permitido ubicar a las bacterias en el reino Procaryotae.

El conocimiento de las diferentes estructuras y composición ha permitido comprender como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismo.

El descubrimiento de que muchas estructuras bacterianas bien identificadas son inmunógenos importantes, permitió el desarrollo de vacunas que han sido verdaderos avances en la medicina de los últimos años. Ejemplo de ello son las vacunas contra microorganismos causantes de meningoencefalitis supurada como Haemophilus influenzae tipo b y Neisseria meningitidis (meningococo) A, B y C.

El conocimiento de la composición bioquímica de las diferentes estructuras bacterianas, junto al conocimiento del metabolismo bacteriano, permite hoy la comprensión del mecanismo de acción de los diferentes antibióticos.
Recientemente, los avances de la genética bacteriana hicieron posible el desarrollo de técnicas de biología molecular con aplicaciones a nivel de la investigación científica y el diagnóstico.
La observación al microscopio óptico con distintas coloraciones y de los cultivos bacterianos, tienen un rol importante en la identificación de las bacterias y su ubicación taxonómica.

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Definición y ubicación taxonómica


Como característica principal, los procariotas no poseen compartimientos intracelulares delimitados por membranas, por lo que carecen de membrana nuclear, a diferencia de los eucariotas. También es importante destacar que el ADN procariota es circular y cerrado, mientras que el eucariota se organiza en cromosomas individuales y se asocia a proteínas de
tipo histonas. Las bacterias poseen una pared celular compuesta por peptidoglicano (a excepción de los Mycoplasmas) mientras que las células eucariotas no tienen este tipo de pared (la pared celular de los vegetales es de celulosa). La reproducción en los eucariotas puede ser tanto sexuada como asexuada, mientras que los procariotas se reproducen por división simple (forma asexuada). El tamaño de la célula eucariota es mayor que el de la procariota.
Los procariotas no poseen citoesqueleto, a diferencia de los eucariotas. Otra diferencia es la presencia de fimbrias o pilis en las bacterias. Los procariotas pueden poseer flagelos, mientras que los de los eucariotas si los poseen, éstos tienen una estructura más compleja. Por último mencionar que mientras las células eucariotas se reproducen por mitosis, las células procariotas lo hacen por fisión binaria. En dicho proceso la célula crece, se forma un tabique y finalmente se desprenden dos células nuevas. En este proceso se produce también la replicación del ADN, de forma que las células hijas contienen cada una un duplicado idéntico del genoma de la progenitora.

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Tamaño

El tamaño de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3 μm, pudiendo llegar en algunos tipos a 10 μm. Las bacterias de interés médico tienen un tamaño entre 0.4 y 2 μm. Solo son visibles entonces, al microscopio óptico o microscopio electrónico. Para observarlas con el microscopio óptico se usa el objetivo de inmersión (100X), sumergiendo esta lente en una gota de aceite (aceite de inmersión) en el preparado a observar. A modo comparativo, una célula eucariota mide más de 5 μm (un eritrocito tiene un diámetro de 7μm), mientras que un reovirus mide menos de 0.1μm. Su tamaño pequeño determina una relación entre la superficie y el volumen elevada, con alta tasa metabólica.

MORFOLOGÍA Microscópica


La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular. Básicamente, se diferencian según su forma en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); dentro de estas últimas se encuentran: Treponema, Borrelia y Leptospira (ver figura 1). Las espirilos varían en el número de vueltas,desde pocas (Borrelia) a muchas (Treponema). Las bacterias pueden mantenerse unidas unas con otras después de la división celular, pero conservando siempre la independencia celular. Si el plano de división es único, podemos encontrar diplococos o cocos en cadena (microorganismos del género Streptococcus). Si los planos de división son muchos, los cocos pueden agruparse en tétradas o en racimos (Staphylococcus). Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden ser redondeados o rectos; pueden estar aislados, en cadenas, en filamentos o formando letras chinas (Corynebacterium). Los bacilos curvos pueden tener forma de coma (Vibrio cholerae).
La morfología bacteriana debe ser observada con el microscopio óptico o el microscopio electrónico, dado el tamaño pequeño de estos microorganismos. El más usado en el laboratorio es el microscopio óptico de campo claro, pero existen otros como el microscopio óptico de campo oscuro en los que los organismos aparecen brillantes en fondo oscuro. Este microscopio permite la visualización de bacterias difíciles de colorear como el Treponema pallidum, agente de la sífilis.
Las bacterias pueden observarse sin tinción (examen en fresco) si se las coloca en glicerol o soluciones no acuosas que aumenten el índice de refracción o con tinción usando distintas coloraciones que mejoran su visualización ya que son células incoloras. Dichas tinciones se basan en la afinidad que presentan los colorantes por las estructuras bacterianas. Los colorantes catiónicos por ejemplo, son atraídos por los componentes de carga negativa como los ácidos nucleicos y los polisacáridos. Ejemplo de este tipo son: el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.


El examen en fresco no es el más usado para observar la morfología bacteriana porque las bacterias tienen citoplasma incoloro y su índice de refracción no difiere mucho del vidrio y del agua. Con esta técnica se puede verificar la existencia de bacterias y evidenciar su capacidad para moverse. El examen en fresco también puede ser usado con técnicas especiales como la tinción con tinta china que nos permite determinar la presencia de cápsula rodeando la bacteria. También puede usarse en el microscopio de campo oscuro por ejemplo para observar Treponemas o Leptospiras con su movimiento característico.
Las coloraciones que se usan para teñir los preparados de bacterias, se pueden dividir en: simples, diferenciales y especiales. Las primeras, por ejemplo el azul de metileno, nos permiten observar la existencia de bacterias, su morfología, su agrupación, la presencia de esporos y la existencia de otros tipos celulares. Las diferenciales (por ejemplo la coloración de Gram y la de Ziehl Nielseen) además de lo anterior, permiten la diferenciación de las bacterias porque usan diferentes colorantes que se comportan distinto según el microorganismo en cuestión.
Las tinciones especiales se usan para objetivar distintas estructuras como la cápsula, el núcleo, los flagelos, los esporos, etc.
Antes de la coloración hay que realizar la preparación y la fijación del frotis. La preparación del frotis consiste en extender homogéneamente la muestra (por ejemplo un cultivo bacteriano) o una suspensión de la misma sobre una lámina. Una vez preparado el frotis debe secarse y fijarse (por ejemplo con calor).
Con la fijación del frotis se pretende obtener la muerte de los microorganismos, la adhesión a la lámina y la conservación de su morfología. Después de preparar y fijar el frotis, se puede realizar cualquier tipo de coloración (simple o diferencial).
La coloración de Gram es la más usada en bacteriología; debe su nombre a quién la describió en 1884. Es una coloración diferencial, dado que las bacterias pueden clasificarse según su respuesta en grampositivas o gramnegativas. Las primeras se tiñen de color azul violeta y las segundas adquieren un color rosado o rojo. La diferente reacción de las bacterias a la coloración de Gram se relaciona con diferencias fundamentales de la envoltura celular de estas dos clases de células.
En el cuadro 1 se muestran los colorantes usados, su tiempo de aplicación y la diferente coloración que adoptan las bacterias grampositivas y gramnegativas en cada paso de la coloración de Gram.

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Estructuras externas o de la envoltura celular


Membrana celular

Es una estructura vital para la bacteria. Representa una barrera que separa el interior del exterior celular. Consiste en una bicapa lipídica similar a otras membranas biológicas, compuesta por fosfolípidos anfipáticos; no posee esteroles a diferencia de las eucariotas (con la excepción de los mycoplasmas). La membrana se halla estabilizada por puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y cationes como el calcio y el magnesio que se combinan con los fosfolípidos cargados negativamente. Insertas en ella se encuentran múltiples proteínas transmembrana, que facilitan el transporte de sustancias hidrofílicas a través de ésta. Como las bacterias no poseen membranas internas todos los sistemas de fosforilación, oxidación y transporte de electrones (citocromos) para la producción de energía se encuentran a nivel de la membrana celular.
Los mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmática que forma vesículas, túbulos o lamelas. Aunque se han investigado durante años, su función exacta aún se desconoce; pueden estar involucrados en la formación de la pared celular durante la división celular o en la replicación del cromosoma y su distribución a las células hijas. Algunos autores consideran que los mesosomas son artefactos generados durante la fijación química de las bacterias para su observación en el microscopio electrónico. Es necesario realizar más investigaciones para solucionar esta polémica.
La membrana celular cumple la función de barrera osmótica, tiene permeabilidad selectiva y permite el ingreso de nutrientes y la salida de desechos por mecanismos de transporte activo y pasivo. En ella se encuentran los sistemas de fosforilación oxidación y el transporte de electrones para la producción de energía; además tiene las enzimas necesarias para la síntesis de lípidos, de la pared celular (por ejemplo, el bactoprenol), de la cápsula, etc. Finalmente la membrana contiene moléculas receptoras especiales que ayudan a las bacterias a detectar y responder a sustancias químicas del medio externo.

Pared celular

Ubicada por fuera de la membrana plasmática, es una estructura vital para las bacterias que la poseen. Los fármacos que bloquean su formación producen la lisis y muerte de las bacterias susceptibles. Excepto los mycoplasmas todas las bacterias tienen una pared celular que les da forma y las protege de la lisis osmótica. La pared celular de muchos microorganismos patógenos tiene componentes que contribuyen a su patogenicidad. La pared puede proteger a la célula de las sustancias tóxicas y es el sitio de acción de algunos antibióticos.
Después de que Christian Gram en 1884 desarrollase la tinción que lleva su nombre, se comprobó que las bacterias podían clasificarse en dos grupos principales, según su respuesta a esta coloración. Las bacterias grampositivas se tiñen de color azul violeta y las gramnegativas adquieren un color rosa o rojo. La diferencia estructural verdadera entre ambos grupos se puso de manifiesto con el desarrollo del microscopio electrónico. La pared de una célula grampositiva está formada por una única capa homogénea de 20 a 80 nm de grosor de peptidoglicano o mureína, situada por fuera de la membrana celular. Por el contrario, la pared de la célula gramnegativa es más compleja; posee una capa de 2 a 7 nm de grosor de peptidoglicano rodeada por una membrana externa.
En las microfotografías electrónicas se observa un espacio entre la membrana plasmática y la externa de las bacterias gramnegativas y, a menudo entre la membrana plasmática y la pared celular en las grampositivas. Dicho espacio se denomina espacio periplásmico y está ocupado por un gel, el periplasma. El espacio periplásmico de las bacterias gramnegativas contiene muchas proteínas que participan en la captación de nutrientes, por ejemplo enzimas hidrolíticas (proteasas, lipasas, fosfatasas, β-lactamasas) que convierten las macromoléculas en productos más pequeños que pueden ser metabolizados por la bacteria. El espacio periplásmico contiene también enzimas que participan en la síntesis del peptidoglicano y en la
modificación de compuestos tóxicos que podrían lesionar la célula. En especies patógenas, también encontramos a ese nivel factores de virulencia como colagenasas, hialuronidasas y proteasas. Es posible que las bacterias grampositivas no tengan un espacio periplásmico visible y secretan enzimas denominadas exoenzimas, que corresponderían a las periplásmicas de las bacterias gramnegativas.

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Estructura de la pared celular de las bacterias grampositivas


La gruesa pared celular de las bacterias grampositivas está constituida principalmente por peptidoglicano. Se cree que ésta gruesa capa de peptidoglicano es la determinante de que estas bacterias retengan el cristal violeta de la coloración de Gram.
Sin embargo, estas células contienen también una gran cantidad de ácido teicoico: polisacáridos que se unen al ácido N-acetilmurámico o a los lípidos de la membrana plasmática.
En este último caso se denomina ácido lipoteicoico. Tanto los ácidos teicoicos como los lipoteicoicos, tienen la función de estabilizar la pared celular. Además los ácidos teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos microorganismos, porque actúan como antígenos de superficie que se unen a receptores específicos en las células del huésped.
La superficie externa del peptidoglicano de las bacterias grampositivas está generalmente cubierta de proteínas. Los diferentes grupos de bacterias grampositivas y las diferentes especies difieren en la composición de sus proteínas y de ácidos.

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Estructura de la pared celular de las bacterias gramnegativas


Si observamos la pared de las bacterias gramnegativas al microscopio electrónico podemos observar tres zonas: la membrana plasmática, el espacio periplásmico que incluye una fina capa de peptigolicano y la membrana externa. Esta última, exclusiva de las bacterias gramnegativas, es una bicapa lipídica que difiere de otras membranas por su capa externa, que está constituida por una molécula anfipática: el lipopolisacárido (LPS) o endotoxina. Además del LPS, la membrana externa contiene fosfolípidos y proteínas que la unen al peptidoglicano.
El LPS está constituido por tres partes: el lípido A, el polisacárido central o del core y la cadena lateral O. (Ver figura 6). La región del lípido A está inmersa en la membrana externa y el resto de la molécula del LPS sobresale de la superficie celular. El core o polisacárido central está unido al lípido A. La cadena O u antígeno O, consiste en unidades repetidas de una subunidad tetrasacárida y es muy variable en su composición entre las diferentes familias, especies y aún dentro de la misma especie de bacterias gramnegativas; en cambio, el polisacárido del core es constante para un mismo género bacteriano. El polisacárido O por su variabilidad es usado frecuentemente para la clasificación serológica de las bacterias.
La mayoría de las bacterias sintetizan moléculas de LPS con un antígeno O de longitud completa, algunas especies fabrican moléculas cortas de antígeno O y otras casi no lo sintetizan.
Las formas con poco o ningún antígeno O se conocen como rugosas, en oposición a las formas lisas productoras de antígeno O de tamaño completo. Macroscópicamente se observan como colonias de bordes rugosos (LPS truncado) o colonias lisas (LPS completo).
Una de las funciones más importantes de la membrana externa es servir como barrera protectora. Evita o disminuye la entrada de sales biliares, antibióticos y otras sustancias tóxicas que podrían destruir o lesionar la bacteria. La membrana externa es más permeable que la plasmática y permite el pasaje de pequeñas moléculas como glucosa y otros monosacáridos.
Dicho pasaje se debe a la presencia de porinas, proteínas integrales o transmembrana que forman canales estrechos por los cuales pasar moléculas menores de 600 a 700 dalton.
Moléculas mayores como la vitamina B12 pueden atravesar la membrana externa por transportadores específicos. Esta membrana externa previene la pérdida de constituyentes como las enzimas periplásmicas.

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Fundamento de la coloración de Gram


Es probable que la diferencia entre las bacterias grampositivas y gramnegativas se deba a la naturaleza física de sus paredes celulares. El peptidoglicano no se tiñe por sí mismo, más bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida de cristal violeta. Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal violeta y luego se tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante. En la decoloración con etanol, se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el complejo colorante yoduro; así las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las bacterias gramnegativas es muy fina, con menos enlaces y con poros de mayor tamaño. Además, es posible que le tratamiento con alcohol extraiga suficientes lípidos de la membrana externa como para aumentar su porosidad. Por estos motivos el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal violeta yoduro en las bacterias gramnegativas.



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